Prosedur analisis total asam amino HPLC (AOAC, 1984).

Prosedur analisis total asam amino (AOAC, 1984).

a.   Preparasi AccQ Fuor TM Reagent kit

1.    Panaskan pemanas sampai suhu 55⁰C

2.    Vial 2A (AccQ Fluor reagen powder) dipanaskan sebentar agar powder dibawah fial

3.    masukkan 1 mL vial 2B (AccQ fluor reagent diluent) kedalam vial 2A

4.    Tutup vial dan kocok selama 10 detik

5.    Panaskan kembali vial 2A kocok sampai powder tercampur rata

b.   Preparasi Standart

·         Pengenceran standart

1.   Standart asam amino H Pierce. Encerkan dengan air samapai 10 mL

2.   Ambil 10 mikrolit stok standart pierce. Encerkan dengan air sampai 10 mL

3.   FP=10.000 mL / 10mL = 1000x. Sehingga konsentrasi standart menjadi 2,5 n mol/ mL

c.   Preparasi solvent

·           Solven A

1.   19 g sodium acetate

2.   2,27 g TEA

3.   40% phosphoric acid

4.   5 mL CAN

Campur 19 gsodium asetat dan 2,27 g TEA dalam 1 lit air. Tambahkan 40% phosphoric acid (± 6 mL / lebih) sampai pH 5,1. Tambahkan 5 mL CAN

·           Solven B          : CAN (Acetonitrile)

·           Solvent C         : Air

d.   Preparasi sampel HPLC atau hidrolisis

1.      Timbang 100 mg sampel.

2.      Masukkan 5 mL 6N HCL

3.      Keringkan sampel dengan nitrogen / argon

4.      Tutup tabung dan masukkan oven pada suhu 112⁰C selama 22 jam

5.      Saring sampel menggunakan 0,45 mikrometer kertas saring

6.      Ambil sampel yang sudah disaring sebanyak 100 mikrolit dan diencerkan dengan miliQ water sebanyak 5 mL

e.   Preparasi sampel HPLC (Derivatization)

1.      Ambil sampel yang sudah diencerkan sebanyak 50 mikro lit

2.      Campurkan dengan 350 mikroliter AccQ derivatiozation buffer dan 100 mikrolit AccQ fluor reagen to derivatize

3.      Dikocok sebentar dan masukan dalam air yang sudah dipanaskan selama 10 menit dengan suhu 55⁰C

4.      Sampel siap diinjeksikan

f.    Analisa Asam Amino

1.    Nyalakan UPS

2.    Nyalakan tombol ditiap-tiap masing bagian (a, b, c, dan d)

3.    Nyalakan adaptor untuk solvent menager

4.    Nyalakan computer

5.    Atur kondisi kromatografi meliputi:

-       temperature 37⁰C

-       laju alir 1 mL/menit

-       detector fluorescence

Eksitasi (ex) : 250 nm

Emisi (em) : 395 nm

6.    Masukkan keprogram total chrom navigator:

run àtake control (untuk mengatur auto sampler dan pump)

è flexar LC à Ok à tunggu

7.    Build Sequence :

Create new sequence à Ok

Instrument : flexar LC

Build : vial by vial àOk

8.    Append new cycles

Type : Blank

Name : Blanko

# of cycles : 2

Vial : 1

Method : amino acid à select

Blok semuanya à klik kanan à edit token string à clear à tokens à sample name à fill down

9.    Selesai à Save asà berinama

10.  Action à set up

Set up parameters :

-     Starting row : 1

-     End row : 5

-     Run : start run when ready

-     Procecing : suppress report/plots à ok

11.  Run à release control (untuk menghentikan pengaturan auto sampler dan pump)

12.  Tutup TC Navigator

13.  Matikan computer

14.  Matikan tiap masing-masing alat (a, b, c dan d)

15.  Matikan UPS